熒光探針是在紫外-可見-近紅外區(qū)有特征熒光，并且其 熒光性質(zhì)可隨所處環(huán)境的性質(zhì)，如極性、折射率、粘度等改變而靈敏地改變的一類熒光性分子。
常用于熒光免疫法中標(biāo)記抗原或抗體，亦可用于微環(huán)境，如表面活性劑膠束、雙分子膜、蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)等處微觀特性的探測(cè)。通常要求探針的摩爾吸光系數(shù)大，熒光量子產(chǎn)率高；熒光發(fā)射波長(zhǎng)處于長(zhǎng)波且有較大的斯托克斯位移；用于免疫分析時(shí)，與抗原或抗體的結(jié)合不應(yīng)影響它們的活性。
熒光探針的化學(xué)性質(zhì)：熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)制劑可分為兩種：熒光探針和熒光染料。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)靶基因的確定及引物和探針的設(shè)計(jì)原則
1.靶基因的確定：選擇檢測(cè)組共有的基因以避免檢測(cè)的假陰性。
2.檢測(cè)片段的確定：選擇檢測(cè)組內(nèi)的保守 、組間特異的序列作為引物探針的設(shè)計(jì)位置。片段長(zhǎng)度70-150bp。
3.引物：長(zhǎng)度17-25bp;GC含量30-80%；退火溫度(Tm值)58-60℃；避免穩(wěn)定的引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)；序列不能出現(xiàn)連續(xù)的G，3’端避免G或C，后5個(gè)堿基內(nèi)避免兩個(gè)以上的G或C。
4.熒光探針：長(zhǎng)度20-30bp(Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值為68-70℃；避免穩(wěn)定的二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)；5’端不能是G；位置盡量靠近上游引物；選擇波長(zhǎng)差異較大或Fam的熒光標(biāo)記。
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